南瓜中降糖功能因子的筛选及其性质研究.pdf

《 食品工业科技》 a n d T e c h n o l o g y o f F o o d I n d u s t ry 2 0 0 2 增刊 南瓜中降糖功能因子的筛选及其性质研究， 张拥军 ‘ 王兰州1 姚惠源2 ( 1 .中国计圣学院生命科学学院 3 1 0 0 3 4 ; 2 .江南大学食品学院 2 1 4 0 3 6 ) 摘要:南瓜具 有多 种食疗保健作用和药用价值，尤其是其抗糖尿病作用最为人们熟知和肯定。目 前， 有 关南瓜防治糖尿病的活性成分的 报道很多。 但其确切的功能因子及防治机理的 研究还处于探讨阶段。本 文借鉴了祖国经典传统方剂有效部位的筛选方法，并结合动物实验在分离的每一阶段对所得各个组分进 行定量评估， 始终追踪活性最强的部分， 逐步筛选出降血糖活性最强的组分—南瓜多糖 ( P P ) ， 并对 其进行了 有效地分离 和纯化。 高效液相色谱( H P L C ) 测得P P的分子 量为1 . 1 5 0 x l O s D a 。 气相色谱( G C ) 分析其单搪组成为葡萄糖、 半乳糖、 阿拉伯糖及鼠 李糖， 硫酸咔哇 法测得其分子中含有少量的已 糖醛酸， H P L C分析其分子中含有一定量的氨基糖。 关 键 词 : 南 瓜 多 搪降 血 糖 卿 分 离纯 化分 析 A b s t r a c t : P u mp k i n b o a s t o f ma n y f u n c t i o n s i n d i e t a ry t h e r a p y a n d h e a l t h c a s e , a mo n g w h i c h t h e a n t i - d i a b e t e s i s t h e m o s t c o mmo n l y k n o w n a n d c o n f i r me d . C u r r e n t r e p o r t s a r e m a n y r e l e v a n t t o t h e p u mp k i n b i o a c t i v e c o mp o n e n t s r e s p o n s i b l e f o r t h e a n t i - d i a b e t i c f u n c t i o n . B u t f e w r e p o rt s h a v e b e e n p u b li s h e d c o n c e r n i n g t h e e x a c t f u n c t io n a l f a c t o r o f t h e b i o a c t i v e c o m p o n e n t s a n d i t s m e c h a n i s m o f p r e v e n t i n g a n d c u r i n g d i a b e t e s . I n v i e w o f a b o v e c o n d i t i o n s , t h e a u t h o r b o r r o w e d c l a s s i c a l s c r e e n i n g me t h o d s o f t h e e f f e c t i v e c o m p o n e n t s o f C h i n e s e t r a d i t i o n a l p r e s c r i p t i o n s a n d b y c o mb i n a t i o n w i t h a n i ma l t e s t , t o a s s e s s e a c h f r a c t i o n i n a q u a n t i t a t i v e ma n n e r a f t e r e a c h s e p a r a t i o n s t e p , f o l l o w t h e f r a c t i o n w i t h h i g h e s t a c t i v i t y , a n d g r a d u a l l y s c r e e n p u mp k i n p o l y s a c c h a r i d e ( P P ) t o b e t h e c o mp o n e n t w i t h t h e h i g h e s t h y p o g l y c e m i c a c t i v i t y , a n d s e p a r a t e a n d p u r i f y i t e f f e c t i v e l y . T h e r e s u l t o f H P L C s h o w e d t h a t t h e mo l e c u l a r w e i g h t o f P P i s 1 . 1 5 0 x 1 0 5 . I t i s c o mp o s e d o f f o u r k i n d s o f mo n o s a c c h a r i d e s : g l u c o s e , g a l a c t o s e , a r a b i n o s e a n d r h o m n o s e b y g a s c h r o ma t o g r a p h y a n a ly s i s , t r i fl e g l u c o r o n i c a c i d w a s i d e n t i f i e d i n t h e m o le c u l e , a n d a f e w a m i n o s u g a r s w a s d e t e c t e d b y H P L C . 1 . 前言 糖尿病是一种常见 病和多发病， 严重 危害人类健康， 近年来发 病率呈显著上升趋势。 在世界卫生组 织发表公报中预测 “ 世界糖尿病成年人的总数到2 0 2 5 年将达到3亿，比1 9 9 5 年增加 1 . 2 2 倍， 将成 为2 1 世纪全球性重大卫生问题” 。 因糖尿病导致的并发症及其带来的费用也令人震 惊， 美国自1 9 8 7 年 起每年直接或间 接用于塘尿病的 经费 开支从2 1 0 亿美元增至1 0 0 0 亿美元。 在我国， 糖尿病的治疗费 用 也以 惊人的速度增加，如不采取积极有效的防治措施，预计今后糖尿病所造成劳动力丧失以 及社会经济 负担将如美国一样严重。因 此， 如何进行糖尿病的防治和保健， 寻找有效地治疗糖尿病的新物质， 特别 是从天然资源中去 筛选和研究降糖成分，已为国内 外医药工作者所关注和瞩目 。 在各种新型的农产品食 品资源中，南瓜作为一种极具开发潜力和开发价值的 农产品资源，引 起了 食品界和医学界专家们极大的 兴趣。 南瓜是葫芦科植物南瓜的果实， 其营养成分全面而独特， 我国 古代就有对南瓜食疗保健作用的记载， 在 《 本草 纲目 》中， 李时珍将南瓜与灵芝放在一起， 说它有“ 补中， 补肝气， 益心气， 益肺气， 益精气” 的作用。近年来的研究结果亦表明，南瓜的营养成分全面而独特，具有多种食疗保健作用和药用价值， 尤其作为一种防治糖尿病的特效营养保健食品倍受人们的重视。据临床试验报道:对空腹血糖在 . 浙江省教育厅资助项目 1 0 6 - n o l o gy o f F o o dI n d u s t ry 2 0 0 2 增刊 8 .2 5 m m o 1 / L 的 轻 度患者， 每天服用5 0 0 8 鲜南 瓜即 有可靠的 疗效; 血 糖在8 . 2 5 m m o 1 / 1 需 配合饮食和 运动疗法:血 糖超过1 1 . 1 m m o 1 / L 的 患者。 可酌 情配 合药 物或胰岛 素治 疗 以上的患者 日前，有关南瓜防治糖尿病的活性成分的报道很多，但有关活性成分的确切功能因子及防治机理还 处于 探讨阶段。 作者对南瓜的 研究己 进行了多年，对其理化性质、工艺技术和营养价值已 进行了 深入的 了 解，正在全面开展南瓜中活性有效成分分离纯化、结构鉴定及其降糖机理的研究，并在此基础上进行 与 其相关的 保健、疗效食品的开发和研究工作。期望该 研究一方面会给医药界提供一种新颖、可靠、 安 全 地防治 疾病的 途径:另一方面能促进当 前多糖类活性物质生产工 业的 产业结构升级，使该产业高新技 术化，真正实现有自 土知识产权的我国多糖类活性物质在国际上的竞争力。 2 .实验方法与结果 2 . 1 南瓜中降血糖有效成分的筛选 选取成熟的南瓜作为加工南瓜粉的原料， 去掉南瓜外表皮籽及瓤后切成薄片晾干，然后用粉碎机将 干燥的南瓜片粉碎成2 0目 左右的南瓜粉。 经以上过程制作的南瓜粉呈桔红色或黄红色、 细腻、 无杂质、 无结块、无霉斑、有明显的南瓜清香味。 南瓜粉用热水抽提后过滤， 滤液回收， 然后按照特定的工 艺路线进行提取， 得到四种组分， 分别为 组 分泌E - A . P C E - B , P C E - C 及P C E - D , 采 用 动 物 实 验 ， 以 小 白 鼠 的 血 糖 值 作 为 检 测 指 标 ， 分 别 验 证四种组分的降血糖效果。测定结果见图2 一 1 及图2 - 2 0 七击 竺 ‘万 - 一.~~ 0甘6 弓0住E -里当目阴OOn-9卫乙-9 、 、 \\ 、 、 、、 叹、 ~、 . ， _. . 65d 刁知0日E 一璧巴口的OU二-口1丝盆口 0 2 4 B 8 1 0 1 2 T I 朋 ( 帅 .P L E A - 0- P C E B ，P C EC 一 .一P C E D 3卜.，.，IL 一 1 一 0 2 4 8 了 tm e ( h ) .P CE A一.一P CE S， 8 1 0 1 2 P CE C 一.一 P CED 图 2 - 1 四种组分对正常小鼠血糖的图2 - 2 四种组分对糖尿病小鼠血藉的作用 作用F ig . 2 - 2 T h e fo u r c o m p o n e n t s o n t h e b lo o d g lu c o s e F i g .2 - 1 T h e f o u r c o mp o n e n t s o n l e v e l i n d i a b e t i c m i c e t h e b l o o d g lu c o s e le v e l i n n o r ma l m i c e 实验结果表明， 组分P C E - A及P C E - D对正常小鼠的血糖浓度降低效果显著， 而对四 氧喻睫型糖尿 病小鼠的血搪浓度影响很小。 因此， 组分P C E - A和P C E - D对搪尿病没有治疗效果. 组分P C E - B对正 常小鼠 及四 氧啼咙型 糖尿病小鼠的血 糖浓度均无影响， 说明组分P C E - B没有降血箱的功能。 组分P C E - C 对正常小鼠 有轻度的降血 糖效果， 对四 氧喀睫型糖尿病小鼠的降血糖效果极其显著，说明组分 P C E - C 的药用价值很大。经检测，P C E - C为南瓜粗多糖类物质。 2 . 2 南瓜多糖的分离纯化 将南瓜粗多 糖 ( P C E - C ) 采用离子交换纤维素柱层析分级，收 集主导组分 ( P C E - C 1 ) 进一步使用 S e p h a d e x G一 2 0 。 分 子 筛 柱 层 析 对 其 纯 化( 图2 - 3 ) ， 苯 酚一 硫 酸 法 检 测 搪 反 应 阳 性的 高 峰 部 分 并 收 集主导 组分， 冷 冻干 燥得到南瓜多 糖 ( P u m p k i n P o l y s a c c h a r i d e , P P ) . 动物实 验 表明， P P 仍具有 很 强的降血 糖活性， 糖尿病小鼠 腹腔注射P P 7 h后基本可使小鼠 的血糖恢复至正常水平， 说明南瓜多糖是 南瓜中的降血箱功能因子。 一1 0 7 · 《 食品工业科技》 S c i e n c e a n d T e c h n o l o gy o f F o o d I n d u s t ry 2 0 0 2 增刊 厂1卜比 扣即的 E I U E O n w l u }.L 1 7 0 I M 图2 - 3 P C E - C 1 在S e p h a d e x G - 2 0 0 柱 的 洗 脱曲 线 F i g .2 - 3 C h r o m a t o g r a p h y o f P C E - C 1 o n S e p h a d e x G - 2 0 0 2 . 3 南瓜多糖 ( P P )的相对分子量测定 将样品 配成2 0 mg / m l 进样。 采用T S K 及U l t r a h y d r o g e l l in e a r ( 7 .8 x 3 0 0 m m ) 色谱柱， 双柱串 联， 示差 折光 检测器 检测， 流 动相为O . 1 M N a N O 3 , 流 速为0 .9 m l / m in 柱温4 5， 进样量2 0 u 1 ， 记录 样 品 色谱曲 线。 按 H P L C测定的 相同 条 件将七种分子量为6 , 1 0 0 ; 1 6 , 5 0 0 ; 2 6 ,2 9 0 ; 4 0 , 0 0 0 ; 8 4 , 0 0 0 ; 1 5 8 , 0 0 0 ; 2 9 1 , 0 0 0的 标 准D e x t r a n 相继进样， 记 录各自 的 保留 时间T R ，以T R 为 横坐标， L o g w t 为 纵坐标， 绘制标准曲 线。 待测样品按上述条件进样， 求得T R ， 通过标准曲 线的回归方程计算多 糖的分子 量。 标准分子量葡聚糖与保留时间的 方程及测定曲 线如图 一 1 所示。 图2 - 4分子量测定标准曲 线 F i g .2 - 4 S t a n d a r d c u r v e o f d e t e r mi n i n g t h e M w 标准分子量葡聚搪方 程: L o g Wt= 1 3 . 1 一 。 .4 6 8 T R 由 上式， 可推算出P P的分子量为1 . 1 5 0 x 1 0 5 D a 2 . 4 pp 的单糖组成分析 称取P P 1 5 .O m g ， 以1 .O r n o l / L 硫酸2 .O ml 封管， 于1 0 0 C 水解6 h ， 饱和B a ( O H ) 2 水溶液中 和， 过滤， 溥液置4 0 ℃下减压蒸干. 然后加入毗睫和盐酸轻胺于水浴中 保持数分钟， 取出后加入乙 酸醉再于 水浴中 保温数分钟， 待样品冷却后， 清液进行G C分析，用标准品 对照， 测得P P中含有葡萄糖、半 乳 糖、阿拉伯糖和鼠 李糖。 2 . 5 己 搪醛酸及氨基糖的测定 己 糖醛 酸含量的测 定采用改良 的 硫酸一 咔哩 法， 测 得P P中己 糖醛酸的 含量为1 1 .7 3 u g / m l ，占 固 形物含量0 . 9 0 2 %0 氨基糖的鉴定采用高效液相色谱法，由于氨基糖在氨基柱上的出峰时间一般晚于单糖组分， 结合单 糖标样图谱，根据 P P酸水解产物在氨基柱上的分离图谱可以推断P P中含氨基糖 ( 图略)。 一1 0 8 《 食品工业科技》 S c i e n c e a n d T e c h n o l o gy o f F o o d I n d u s t ry 2 0 0 2增刊 3 .前景与展望 随着生活水平提高， 人们健康意识的增强， 饮食正向 营养化保健化方向 发展， 人均占有量而言，美国是 国大陆只有2 . 9 2 美元/ 人 8 4 .4 2 美元/ 人，日 本 是5 1 .5 9 美元/ 人，中 国台 湾是 就健康 ( 保健) 食品 3 0 . 7 0 美元/ 人。 而中 ，因此我国的保健食品的市场的容量是十分巨大的。 利用我国丰富的南 瓜资 源， 提取和分离具有降血糖功效的 活性南瓜多 糖，探讨其降搪机理，并进一 步开发含有南瓜多糖类功能食品 ( 如南瓜多搪口 服液、南 瓜多 糖饮料、南瓜多 糖胶囊等)， 具有现实和 广阔的前景。目 前， 市场上还没有出 现这种类型的 健康食品 及药品 销售，因此， 通过合理引导消费者和 确保产品的质量后，本项目 进一步的产业化势必实现产品的商业化，并可能使我国的相关产品能够走向 世界，这样， 将带来非常可观的经济效益。 降血 糖活性南瓜多糖的 研究对糖尿病的防治亦提供了 一种新颖、安 全、可靠的途径。 糖尿病作为一 种常见病和多发病， 具有终身性、心身性和全身性三大特点，故 对药物治疗提出了 更高要求。目 前搪尿 病的发 病机理仍不十分清楚，临床治 疗主 要利用药物及胰岛素 控制血 糖升高及防治并发 症。 其中，药 物 治疗均有不同程度的 副作用，且无法根本阻止 胰岛细胞的 进一步坏死， 往往导致胰岛素依赖。因 此，寻 找有效地防治糖尿病的新物质， 同时 促进南瓜的综合利用与深度开发， 具有重要的现实意义和社会效益， 作者简介‘ 张 拥军，女，1 9 7 1 年生 博士 从事天然植物资源的深度开发与综合利用 通信地址:浙江省杭州市学院路1 2 9 号 中国 计量学院生命科学学院 邮政编码:3 1 0 0 3 4 联系电话: ( 0 5 7 1 ) 8 8 3 2 0 6 7 1 , 8 8 0 7 5 0 2 4 - 8 2 9 8 E - ma i l : y j z h a n g 7 l @h o t ma i l . c o m .1 的.