H3亚型鸭源流感病毒聚合酶PB1基因的序列分析.pdf

中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集 下水禽仍然只是禽流感病毒的天然贮存宿主。更重 要的是， 即使水禽体内含有高滴度的禽流感病毒抗 体， 禽流感病毒也可能在其体内不断地增殖， 并通过 呼吸道或泄殖腔不断地向外周环境排毒。 因此， 在监 测水禽体内的禽流感病毒抗体时， 同时还应监测其 体内是否仍然存在禽流感病毒; 第五， 坚决杜绝鸡、 鸽、 鹤鹑与鸭、 鹅、 猪等混合饲养; 第六， 由于不同禽 场的规模、 所处的地理位置、 管理方式以及疫情状 况、 不同批次禽群的母源抗体水平等各不相同， 为了 确保万无一失， 各养禽场最好请本场兽医或顾问根 据本场的实际情况， 尤其是根据本场不同批次禽苗 的母源抗体整体水平状况， 制定比较灵活的适合本 场的禽流感免疫程序。 参考文献 略 H 3 亚型鸭源流感病毒聚合酶P B 1 基因的序列分析 樊玉磊， 刘金华， 吴清民， 张国中 ( 中国农业大学动物医学院 北京 1 0 0 0 9 4 l j h @c a u . e d u . c n ) 〔 摘要〕 水禽是禽流感病毒的贮存库， 人流感与禽流感关系密切; H 3 亚型流感在人群中常发生流行， 调查表明H 3 亚 型流感病毒在水禽中的携带率较高。 为了阐明H 3 亚型鸭流感病毒与其他亚型流感病毒的关系， 本研究对自活禽市场分离的3 株H 3 N 8 亚型鸭源流感病毒聚合酶P B 1 基因进行了序列分析。 结果表明， 3 株鸭源H 3 N 8 流感病毒聚合酶P B 1 基因核昔酸同 源性为9 9 . 9 0 o ， 与H 9 N 2 亚型流感病毒( D K / S T / 2 1 4 3 / 0 0 ) 的同源性为9 6 . 3 1 %-9 6 4 4 %， 而与H 3 N 8 亚型鸭流感病毒( M a l / A l b e r t a / 2 7 9 / 9 8 ) 为8 8 . 6 5 0 o - 8 8 . 7 9 0 0 . 系统进化树分析表明， 本实验中的3 株病毒属于相同的分支， 且与A / d u c k / H o n g K o n g / Y 4 3 9 为代表的H 9 N 2 亚型禽流感病毒位于一进化分支， 说明三株H 3 N 8 亚型流感病毒重排了H 9 N 2 亚型禽流感病毒 的基因片段。 不同亚型禽流感病毒在贮存宿主体内的重排以及重排病毒的新特点如鸭H 3 N 8 亚型流感病毒对鸡致病性， 应当 引起我们的高度重视。 〔 关键词〕 禽流感病毒; H 3 N 8 ; 聚合酶P B 1 基因; 系统进化分析 A型流感病毒根据表面糖蛋白的抗原性的不 同， 至少为 1 5 个H A亚型和 9 个N A亚型， 所有流 感病毒的亚型都可以从水禽中尤其是迁徙野鸭分离 到， 因此， 野鸭是所有亚型禽流感病毒的自然贮存宿 主。 通常认为， 人流感与动物流感病毒尤其禽流感病 毒有着密切关系， 在人群中， H 3 和H 1 亚型流感病 毒是引起人流感流行的常见亚型。流感病毒含有 8 个基因片段， 分别编码 1 0 种不同的蛋白; 流感病毒 的内部蛋白基因一聚合酶复合体是由 3 种成分构 成， 分别是P B 2 , P B 1 , P A， 对病毒核酸的复制起重 要作用。 基因组研究表明发生于2 0 世纪的人类的4 次流感大流行中， 有 2次引起流行的流感病毒其 P B 1 基因来自 于禽类而形成重排病毒。 因此， 研究禽 源尤其是水禽流感病毒的P B 1 基因在禽流感病毒 的分子流行病学调查中起重要作用。 基于此， 本研究 对分离到的3 株H3 鸭源流感病毒的聚合酶P B 1 基 因进行了序列测定与分析。 I 材料与方法 1 . 1 病毒3 株H 3 N 8 亚型禽流感病毒系本实验室 自活禽市场健康家鸭的咽拭子和泄殖腔拭子所分 离， 通过血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴定 其亚型。 其名称及简称如下: A / d u c k / B e i j i n g / 3 3 / 0 4 ( D k / B J / 3 3 / 0 4 ) ， A / d u c k / B e i j i n g / 4 0 / 0 4( D k / B J / 4 0 / 0 4 ) , A / d u c k / B e i j i n g / 4 4 / 0 4 ( D k / B J / 4 4 / 0 4 ) 。 本 研究中用于序列分析的其余流感病毒P B I 基因自 G e n B a n k中下载读取。 1 . 2引物依据G e n B a n k发表的流感病毒聚合酶 P B 1 基因的序列， 用软件O l i g o 6 . 0 设计P C R引物， 上游引物P B l F : 5 ‘ 一 T C A A T C C G A C T T T A C T T T T C T T-3 ( 3 2 -5 3 ) ; 下游引物 M R: 5 ， 一 G GG AGT C C A G A T T G C T C A A一 3 ( 8 2 1 一 一2 3 2 一 禽流感 8 4 0 ) ， 预期扩增片段为8 0 9 b p , 1 . 3病毒R N A的提取用 P r o me g a R N A提取试 剂盒， 从尿囊液中提取病毒的R N A， 操作方法按说 明书要求进行。 1 . 4 逆转录P C R和P C R产物的测序取以上制备 好的R N A 2 p .L ， 与反转录通用引物U n i 1 2 ( 5 ‘ 一 A G C A A A A G C A G G一3 ) 合成第一链 。 D N A， 再 用以上合成的引物进行P C R扩增P B l 基因片段。 扩增程序为: 9 4 ℃预变性 3 m i n ， 然后 9 4 *C 3 0 s , 5 5 C I m i n , 7 2 0C 2 m i n ， 进行 3 0 个循环， 最后7 2 ℃延伸 7 m i n , P C R产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定， 用 华美公司胶回收试剂盒回收P C R产物。 将纯化回收 的P C R产物送华大基因公司测序。 1 . 5 数据分析与处理测序结果经A u t o A s s e m b l e 软件编辑整理， G e n e t y x软件进行核昔酸序列的比 较分析， 氨基酸采用D N A S I S软件分析处理。系统 进化分析采用P H Y L I P软件在 I n t e r n e t 网上分析 处理( h t t p , / / s p i r a l . g e n e . n ig . a c . j p / h o m o ; o g y / c l u s t a l w) ， 分析数据用T r e e V i e w软件绘制系统进 化树[ Q 0 2 结果与分析 虽然许多不同亚型的禽流感病毒在水禽中可持 续存在， 但调查表明在水禽中H3 亚型禽流感病毒 是流行和传播的主要亚型之一[[ 2 1 。 作为贮存宿主， 水 禽通常不表现临床症状， 但当H 3 亚型流感病毒感 染鸡只后， 可会造成鸡的发病与死亡[[ 3 . 4 3 。由于H 3 亚型鸭源禽流感病毒对其他家禽有着一定的威胁 性， 以及H3 亚型禽流感病毒P B 1 基因在以往人流 感大流行中发挥着重要角色， 因此， 本试验对所分离 到的3 株H 3 亚型鸭流感病毒的P B 1 基因进行了序 列的测定与分析。 在本研究中， 所分析的3 株鸭源H 3 N 8 流感病 毒的聚合酶P B 1 基因片段的可读碱基数目 为7 5 8 b p ( 因测序反应中模板的起始部分不能正确读出， 因此 可读片段比P C R扩增片段短) ， 测序结果已在 G e n B a n k 上 登 陆，序 列 号 为:D Q3 7 3 9 9 9 9 D Q3 7 4 0 0 0 , D Q3 7 4 0 0 1 。根据测得的聚合酶P B I 基 因核昔酸碱基序列进行了同源性比较， 3 株鸭源 H 3 N 8 流感病毒的聚合酶P B 1 基因之间的核昔酸同 源性为”. 9 %， 说明所分离到的3 株鸭源H3 N 8 流 感病毒的聚合酶P B 1 基因同源性非常高。3 株鸭源 H3 N8 流感病毒的聚合酶P B 1 基因与不同亚型的流 感病毒P B I 序列比较， 结果表明与H9 N 2 ( D K / S T / 2 1 4 3 / 0 0 ) ， H5 N1 ( D k / S T / 4 0 0 3 / 0 3 ) ， H3 N8 ( Ma l / A l b e r t a J 2 7 9 J 9 8 ) 以及人H 3 N 2 ( N Y / 1 0 / 0 4 ) 流感病 毒的聚合酶P B I 基因的同源性分别为9 6 . 3 1 %一 9 6 . 4 4 % a ， 9 3 . 0 1 %一9 3 . 1 4 % o ， 8 8 . 6 5 %一8 8 . 7 9 0 o ， 8 7 . 4 7 肠-8 7 . 6 0 0 0 .同源性比较结果表明， 鸭源 H 3 N 8 分离株的聚合酶P B I 基因在遗传进化上与 H9 N2 亚型病毒有很近的亲源关系。 流感病毒聚合酶P B 1 基因的系统进化分析表 明， 3 株鸭源H 3 N 8 流感病毒分离株都属于同一个 进化分支， 与H 3 N 8 亚型的其它毒株不在一个进化 分支上， 而与以A / d u c k / H o n g K o n g / Y 4 3 9 为代表 的H9 N 2 病毒聚合酶P B I 基因在同一个进化分支 上。我国自1 9 9 2 年以来， H 9 N 2 亚型禽流感时有流 行和散发， 且该亚型系引起我国鸡流感的主要亚型， 业已对我国的养鸡业造成了严重损失。 因此， 同源性 分析和系统进化分析结果充分说明了我们于2 0 0 4 年自健康家鸭体内所分离的3 株H 3 亚型流感病毒 的P B I 基因可能来源于H 9 N 2 亚型禽流感病毒， 分 析该结果， 可能说明以下三个问题: 1 、 该 3 株鸭源流 「 感病毒为重排病毒。2 , 3 株病毒的P B 1 基因来源于 鸡说明鸭已受到了带毒鸡只的反向传播， 该分析结 果与C h e n H等所发表的结果相一致[[ 5 ] 0 3 、 在我国， H 9 N 2 亚型禽流感病毒在最近几年虽然发病率较 低， 但病毒基因在禽群仍然持续存在。 较早期， H 9 N 2 亚型禽流感病毒对我国的养禽 业造成了严重冲击， 人们对其给予了高度重视; 但最 近几年的高致病性禽流感H 5 N1 亚型禽流感病毒在 家禽中的发生， 在一定程度降低了人们对H 9 N 2 亚 型流感病毒的重视， 我们的调查表明， H9 N2 在不少 部分养鸡场中依然存在， 并是造成肉鸡死亡的主要 病毒病之一( 未发表资料) 。 水禽是禽流感的宿主， 可 传播与鸡只等家禽， 反过来， 鸡只等陆地禽的流感病 毒在与水禽混养时又可传播于水禽， 从而形成双向 传播。 因此， 对禽流感病毒的双向传播应当引起人们 的重视， 因为双向传播的发生会大大增加病毒的进 化速度， 对病毒的 感染性、 致病性和 个 体鑫rl-31 M传播 一2 3 3 一 中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集 性都会有重要作用， 尤其是H 3 亚型流感病毒对鸡 的致病性以及H3 病毒在养殖业中的存在状况必须 要密切关注。 H3 亚型流感病毒是引起人流感流行主要亚型 之一， 而且 H 3 N 8 亚型也是引起马流感的主要亚 型1 6 1 ， 所以， 在对流感病毒的监测中， 对H 3 亚型流 感病毒应当给予高度的重视。在过去人流感的大流 行中， P B 1 基因都参与了病毒的重排， 间接说明在对 人致病作用的发挥或许起到了重要作用， 因此， 对流 感病毒的内部基因P B 1 基因的序列信息和功能都 要做深人的研究。 最近又有报道在越南一名4 3 岁男 子死于H 3 亚型禽流感病毒[ 7 1 。 因此， 所有这一切说 明了加强禽流感病毒调查研究， 对疫苗株的筛选和 获取更多的信息以应对未来流感的大流行具有重要 意义。 p r e v a l e n t i n c h i c k e n s i n C h i n a d u r i n g 1 9 9 5 一2 0 0 2 [ J ] . V i r u s Ge n e s , 2 0 0 3 , 2 7 : 9 7 一2 0 2 . P a s i c k J . ， We i n g a r t l H . ， C l a v ij o A . ， e t a ] . C h a r a c t e r iz a t i o n o f a v i a n i n f l u e n z a v i r u s i s o l a t e s s u b mi t t e d t o t h e Na t i o n a l 参考文献 [ 1 ] L iu J . H . ，O k a z a k i K . ， a n a l y s i s o f n e u r a m i n i d a s e S h i W. M. ，e t a l . P h y l o g e n e t i c g e n e o f H 9 N 2 i n f l u e n z a v i r u s e s C e n t r e f o r F o r e i g n A n i m a l D i s e a s e b e t w e e n 1 9 9 7 a n d 2 0 0 1 [ ) ] . Av i a n D i s , 2 0 0 3 , 4 7 ( 3 ) : 1 2 0 8 一1 3 . C a m p it e l l i L . ， F a b i a n i C . ， P u z e l l i S . ， e t a l . H 3 N 2 in f l u e n z a v ir u s e s f r o m d o m e s t ic c h ic k e n s in I t a l y , a n in c r e a s in g r o l e f o r c h i c k e n s i n t h e e c o l o g y o f in f l u e n z a ? [ J ] . J G e n V ir o l , 2 0 0 2 , 8 3 ( P t 2 ) , 4 1 3 : 4 2 0 . 、 崔尚金， 于康展， 唐秀英， e t a l . H 3 亚型禽流感病毒分离株与 变异株的生物学特性[ ) ] .中国预防兽医学报， 2 0 0 0 , 2 2 , 8 5 一 8 9 . L i K . S . ， X u K . M. ， P e i r i s J . S . ， e t a l . C h a r a c t e r i z a t i o n o f H 9 s u b t y p e i n f l u e n z a v i r u s e s f r o m t h e d u c k s o f s o u t h e r n C h i n a , a c a n d i d a t e f o r t h e n e x t i n f l u e n z a p a n d e m i c i n h u m a n s ? [ J ] “ J V i r o l , 2 0 0 3 , 7 7 ( 1 幻: 6 9 8 8 一9 4 . G u o Y . ， Wa n g M . ， K a w a o k a Y . ， e t a l . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n e w a v ia n 一l i k e in f l u e n z a A v ir u s f r o m h o r s e s in C h in a [ J ] . V i r o l o g y , 1 9 9 2 , 1 8 8 ( 1 ) : 2 4 5 一5 5 . h t t p , / / w w w . n e w s s c . o r g / g b / N e w s a c / m e i t i / c d r b / g j y w / u s e r o b j e c t 1 0 s i 8 1 8 9 7 0 . h t m l R N A干扰抗A型流感病毒的研究’ 周红波， 金梅林# ， 喻正军， 徐晓娟， 彭亚平， 刘金林， 伍海芽， 刘虎， 陈焕春 ( 华中农业大学动物医学院动物传染病实验室 武汉4 3 0 0 7 0 ) 本研究选用流感病毒中高度保守的N P和M2 基因作为R N A干扰的靶基因， 针对 N P基因保守 区段设计T2 对s i R N A( N P 7 4 9 , N P 1 3 8 3 ) ， 针对M2 基 因保守区段设计了 3对 s i R N A ( M4 8 , M7 5 4 , M9 4 9 ) ， 通过载体介导， 研究了这些 s i R N A对基因 表达的影响及其对H1 N1 和H9 N 2 流感病毒在体内 和体外复制的影响， 筛选出能有效抑制流感病毒复 制的s i R N A序列， 为探索R N A i 技术应用于抗禽流 感研究奠定基础。 通过P C R方法克隆了禽流感病毒A/ c h i c k e n / H u b e i / 3 2 7 / 2 0 0 4 N P和M2 基因的编码区， 并采用 P C R方法缺失了M2 基因跨膜区的第 2 6 -5 5 位氨 基酸( AM2 ) ， 将两个基因分别亚克隆至载体 p C D M 4 中， 构建以E G F P为报告基因的融合表达 质粒， 并实现了N P和△M2 基因分别同E G F P在 H e L a 细胞中的融合表达， 融合蛋白呈弥散状分布 于整个胞浆。 1 N P和△M2 基因同E G F P在H e L a 细胞中的融合 表达 2 s i R N A抑制N P和△M2 基因在 H e L a细胞中的 表达 将p C D M -N P和p C D M一△M2 分别与对应 .电子邮件: h b z h x x @y a h o o . c o m . c n#通讯作者: 金梅林教授 一2 3 4 一