DPV强毒滴鼻对雏鸭呼吸道大肠杆菌、葡萄球菌和乳酸杆菌数量的影响.pdf

中国畜牧兽医学会动物微生态学 分会第三届第八次学术研讨会论文集 ( 2 0 0 6 年广州) D P V强 毒滴鼻对雏鸭呼吸道大肠杆菌、葡 萄球菌和乳 酸杆菌数量的 影响 胡骑’ 夕 ， 程安春’ ,2汪铭书’ ,2 ， 刘艳丽’ 汉 ， 陈孝跃’ ( 1 . 四 川 农 业 大 学 动 物 科 技 学院 禽 病 防 治 研究中 心 ， 6 2 5 0 1 4 ; 2 . 动 物 疫 病 与 人 类 健 康四 川 省 重 点 实 验 室， 四 川雅 安 ， 6 2 5 0 1 4 ) 摘要: 利用本实验室建立的荧光定量P C R ， 检测D P V强毒经口 服感染鸭及其相应的同居感染鸭呼吸 道大肠杆菌/ 葡萄球菌/ 乳酸杆菌数量的动态变化，结果发现:同居鸭大肠杆菌显著高于对照 ( P 0 .0 5 ) : 葡萄球菌显著低于对照 ( P 0 .0 5 )而同居鸭极显著高于对照 ( P 0 . 0 1 ) ;乳酸杆菌极显著高 于对照 (( P 0 .0 1 ) ，且同居鸭显著高于对照 (( P 0 .0 5 ) 关键词:D P V ;呼吸道:大肠杆菌;葡萄球菌;乳酸杆菌 呼吸道正常菌群绝大多数都是厌氧或兼性厌氧菌， 能用普通培养基直接培养出来的尚 不及全部微 生物种类的 1 %， 大多数菌种仅依靠传统的分离培养和生化鉴定是一项费时而繁琐的工作。荧光定量 P C R技术， 可以直接探测P C R反应过程中荧光信号的变化以获得定量的结果， 不需要P C R后处理或 电泳检测。本文参照 G e n e b a n k 大肠埃希氏菌属/ 葡萄球菌/ 乳酸杆菌属 1 6 S r D N A保守基因序列设计并 合 成 定 量P C R引 物 及 针 对大 肠 杆 菌 属 / 葡 萄 球 菌 / 乳 酸 杆 菌 属的T a q m a n 探 针， 利 用 本 试 验 室 建 立的 检 测大肠杆菌 嘀萄球菌/ 乳酸杆菌定量P C R方法， 检测D P V强毒感染鸭后呼吸道大肠杆菌 / 葡萄球菌 / 乳 酸杆菌数量变化规律获得重要结果。 1 材料与 方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 参考菌株 大肠杆菌A T C C 2 5 9 2 2 株、金黄色葡萄球菌9 9 0 9 2 8 株和短乳酸杆菌标准菌株，由 本实验室保存。 1 . 1 . 2 试验鸭 2 0日 龄樱桃谷鸭，购于某规模化商品鸭养殖场. 1 . 1 . 3 主要试剂 P r o te in a s e K ( M e r c k ) ; R N a s e ( S ig m a ) , T r ito n X - 1 0 0 ( A m r e s c o ) ; 硅 胶 模 型 P C R 产 物 纯 化 试 剂 盒( 北 京 赛 百 盛 基 因 技 术 有 限 公 司) ; 琼 脂 糖( B io w e s t , R e g u la r ) : 普 通P C R T a q 酶( 北 京 赛百 盛 基 因 技 术 有 限 公 司 ) ; 定 量P C R 热 启 动 酶 ( 大 连 宝 生 物 有 限 公 司 ， T a K a R a E x T a g T m R - P C R V e r s io n 2 . 1 ) ; 1 . 1 .4 引物与探针 1 . 1 .4 . 1定量P C R引 物与探针 ( 1 ) 大肠杆菌 属 上游引 物位于大肠杆菌 1 6 S r D N A的1 2 3 7 ^ - 1 2 5 8 b p处， 下游引 物位于大 肠杆菌 1 6 S r D N A的1 3 0 0 -1 3 1 9 b p 处， 扩增片 段 长为8 3 b p o F P : 5 - A A T G G C G C A T A C A A A G A G A A G C - 3 ; R P : 5 - G TT G C AG A C T C C A A T C C GG A 一’ ; T a q m a n 探 针 位 于 大 肠杆 菌1 6 S r D N A的1 2 6 5 -1 2 9 1 b p 处 ， 5 ’ 一( 6 - F A M) C A C T T T A T G A G G T C C G C TT G C T C T C G C ( T A MA R A)- 3 . ( 2 ) 葡萄 球菌 属 上游引 物 位于 金黄 色葡 萄球 菌1 6 S r D N A的3 9 7 - 4 1 9 b p 处， 下 游引 物 位于5 2 2 ^ 5 4 6 b p 处， 扩 增片 段长为1 5 0 b p o F P : 5 - T G AG T G A T G AAG G T C TT C GG A T C - 3 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集 ( 2 0 0 6 年广州) R P : 5 - A T A AC G C TT GC C AC C T AC G T A TT A C - 3 ; T a g m a n - M G B 探针 位于 金黄 色葡萄 球菌1 6 S r D N A的4 6 5 - 4 8 3 b p 处， 5 ’ 一( 6 - F A M) C A C A T C TT G A C G G T A C C T A ( MG B )- 3 0 ( 3 ) 乳酸杆菌 属 上游引 物位于短乳杆菌1 6 S r D N A 的1 0 5 7 ^ 1 0 8 1 b y 处， 下游引 物位于1 1 5 1 .1 1 6 9 b p 处， 扩增片段长为1 1 3 b p o F P : 5 - GT GT C G T G AG A T G TT GGG T T A AG T C - 3 ; R P : 5 - C C A C C TT C C T C C G G “ 1 - 1 - t ,G T 3 ; T a q m a n 探针 位于短 乳杆 菌1 6 S r D N A的1 0 9 2 ^ - 1 1 1 8 b p 处， 5 ’ 一( 6 - F A M) C G C A A C C C TT A TT A T C A G TT G C C A G C A ( T A MA R A)- 3 。 1 . 1 . 4 . 2 制备标准品的P C R引物 ( 1 ) 大 肠杆菌属 上游引 物位于大肠杆菌 1 6 S r D N A的1 1 0 3 -1 1 2 3 b p处， 下游引 物位于大 肠杆菌 1 6 S r D N A的1 3 2 6 ^ 1 3 4 8 b p 处， 覆盖了1 . 1 .4 . 1 中 大 肠杆菌 属定量P C R引 物扩增片段， 其扩增片段长 为2 4 6 b p o F P : 5 - G AGC G C AAC C C TT A T C C “1 - 1 - 1 }G- 3 ; R P 二5 - T AC T AGC G A TT C C G A C TT C A T G G - 3 。 ( 2 ) 葡 萄 球菌 属 上 游引 物 位于 金 黄 色 葡 萄 球 菌1 6 S r D N A的3 1 6 - 3 3 7 b p 处， 下 游引 物 位 于 金 黄 色 葡 萄 球 菌1 6 S r D N A的5 8 5. 6 0 6 b p 处， 覆 盖了1 . 1 .4 . 1 中 葡 萄 球 菌 属 定 量P C R 引 物 扩 增 片 段， 其 扩 增 片 段 长 为2 9 1 b p o F P : 5 - G A G A C AC G G T C C A G A C T C C T A C - 3 ; R P 二5 - T G G G CI - t - t }C A C A T C A G A C TT A A - 3 。 ( 3 ) 乳酸杆菌 属 上游引 物位于短 乳杆菌 1 6 S r D N A的9 7 2 ^ - 9 9 5 b p处， 下游引 物 位于 短乳 杆菌 1 6 S r D N A的1 2 0 7 -1 2 2 9 b p 处， 覆盖了1 . 1 .4 . 1 中 乳酸杆菌 属定量P C R引 物扩增片段， 其扩增片段长 为2 5 8 b p o F P : 5 - GT GT C GT GAGA T GTT GGGTT AAGT C - 3 ， R P : 5 - C C AC C TT CC T C C GGI - I - I }GT 3 。 以上引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成。 1 . 2方法 1 .2 . 1 动物感染分组设计 4 8 只2 0日 龄未免疫樱桃谷鸭，分为口 服实验组、口 服同 居实验组及正常对照组。正常对照组接种 生理盐水0 .2 5 m l/ 只，除同居实验组外实验组感染接种D P V强毒0 .2 5 m ll 只。 1 .2 .2采样设计 1 .2 .2 . 1 采样时间 , D P V强毒感染后2 h , 4 h , 8 h , 1 2 h , 2 4 h , 3 6 h , 4 8 h , 7 2 h , 6 d , 9 d , 1 2 d , 1 5 d 分别采样，同居 鸭在感染组感染后 1 2 h 开始采样， 对照组采样时段与感染组等同， 每个采样时间点各采鸭2 只。 1 .2 .2 .2采样部位 各组实验鸭按照设计的采样时间点， 颈静脉放血处死后采样。 呼吸道采集气管全段， 呼吸道采 集食道， 十二指 肠、 空肠、 回 肠、 盲肠、 直肠全段， 参照文献对样品 进行处理: ①剪 碎， 加入5 m lP B S , 混 匀， 1 5 0 0 r p m , 8 m i n ， 取 上 清; 8 0 0 0 r p m , 1 O m i n ， 取 沉 淀， 溶 于5 m lT E , 1 0 0 0 0 r p m , 5 m in : ② 取 沉淀， 加入2 m l - 2 0 C 预冷的丙酮， 混匀，1 0 0 0 0 r p m , 5 m in ， 取沉淀， 重复两次.I O O O O r p m , 5 m in 5 3 2 中国 畜牧兽医 学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集( 2 0 0 6 年广州) 取沉 淀; 3 0 0 g l T E , 5 0 P d 溶菌 酶( 1 0 m g / m l ) , 3 7 1C 4 0 S D S ) , 5 5 ℃过夜; 分别用酚、 酚/ 氯仿/ 异戊醇 ( 2 5 :2 4 : m m ;等体 积3 0 0 g l 裂 解液( E D T A , T ri t o n X 1 0 0 , 1 ) 和氯仿/ 异戊醇 ( 2 4 : 1 ) 各抽提一次; 异丙醇， - 2 0 C 沉淀4 h ; 1 2 0 0 0 r p m , 1 0 m in ， 取沉淀: 7 0 % 乙 醇I m l 沉淀2 0 m in , 1 0 0 0 0 r p m , 干燥后加 入4 0 川 T E 于 一 7 0 ℃ 保存备用. 1 . 3结果分析以本实验室建立的的反应体系及反应条件进行菌群检测和数据处理分析。 1 0 0 0 闪 5 mi n : 2 结果 2 . 1 发病和死亡情况 未出 现明显病理变化及症状， 至感染后3 6 0 h ( 1 5 d ) ， 也无明显病理变化和症状。整个过程均未 出现死亡。 2 . 2鸭人工滴鼻感染D P V 强毒后呼吸道大肠杆菌/ 葡萄球菌/ 乳酸杆菌数量的动态检测 D P V 强毒滴鼻 感染鸭 后 2 - 3 6 0 h 共1 0 个时间 点 大肠杆菌 / 葡萄 球菌 / 乳酸 杆菌数量 变化见 表1 , 感染 鸭的气管大肠杆菌/ 葡萄球菌/ 乳酸杆菌数量出现很大的波动， 而未感染的对照鸭气管的大肠杆菌/ V 萄球菌/ 乳酸杆菌数量相对稳定。 表1 鸭人工滴鼻感染D P V 强毒后呼吸道大肠杆菌/ 葡萄球菌浮L 酸杆菌数量的动态检测 1 2 h2 4 h 大肠杆菌 11口J工JO月崎n西 n﹄，夕门产-660 ，‘OJ6工fJ，声弓︺ 感染组 同居组 对照组 感染组 同居组 对照组 感染组 同居组 对照组 葡萄球菌 乳酸杆菌 7 . 7 1 7 . 8 0 1 0 . 7 9 9 . 2 3 1 0 . 0 4 9 . 科 9 . 0 2 7 . 6 1 8 . 1 6 8 . 5 3 6 . 5 7 1 0 . 0 4 1 0 . 5 1 9 . 9 8 9 . 7 7 9 . 4 7 7 . 8 4 5 . 7 3 1 0 . 0 7 9 . 1 7 1 0 . 4 0 6 . 0 5 1 2 . 5 1 8 . 9 8 6 . 4 7 7 . 3 6 8 . 0 0 8 . 5 2 7 2 h 8 . 6 1 1 0 . 0 9 9 . 6 5 7 . 5 8 1 2 . 2 0 9 . 5 4 3 . 5 7 8 . 2 2 7 . 6 5 1 4 4 h 9 . 8 7 1 0 . 9 9 1 0 . 0 9 7 . 8 8 1 1 . 3 0 8 . 5 4 8 . 7 2 7 . 8 9 5 . 5 8 2 1 6 h 9 . 7 0 1 0 . 9 6 9 . 7 0 8 . 0 0 1 0 . 3 1 8 . 0 7 9 . 4 0 9 . 4 0 6 . 2 7 2 8 8 h 1 0 . 2 9 1 1 . 4 4 9 . 2 6 3 6 0 h 1 0 . 9 9 1 1 . 4 4 9 . 6 8 8 . 1 2 9 . 9 5 1 0 . 0 2 9 . 8 6 7 . 3 9 4 . 5 2 3 讨论 呼吸道各部位的微环境是很复杂的。除机体方面的生态空间 及其与外环境进行气体交换的过程 构成呼吸道微观环境的重要组成部分外，由于这一通道对外界是开放的，在个体出生后不久， 微生 物群落 ( 包括细菌、病毒等)就不可避免地要介入了。它们在呼吸道不同生态位中定植，在健康情 况下不致病， 有的还可与细胞表面受体相结合， 阻碍后来进入的致病微生物侵袭， 起到屏障的作用。 即动物机体气管内的微生物群落有相互协同关系，正常的共栖菌群可以帮助其宿主对抗致病微生物 的 入侵。 本试验发现正常鸭呼吸道 ( 气管)内 大肠杆菌数量非常大， 与呼吸道内 大肠杆菌数量差异 并不很显著， 这可能是因 为 饲喂了 含有抗生素的 饲料或使用了 抗生素， 消灭了呼吸道的正常菌群， 出现了空缺，大肠杆菌便可以 在呼吸道内 定植。 肖 纯凌等发现大气污染大鼠 模型口 咽部微生态发生改 变:与 污染前比， 致病菌检出率明 显增加 ( P 0 .0 5 ) ， 厌氧菌含量明 显减少(( P 0 .0 5 ) ， 并且随着染毒时间 厌氧菌和细菌总平均密度都呈明 显 下降 趋势 (( P 0 .0 5 ) 。 同居组从开始的1 2 h , 2 4 h 显著低于对照一个数量级左右到7 2 h 至2 1 6 h 于对照没有显著差别， 再到2 8 8 h 和3 6 0 h 的显著高于对照一个数量级以 上，与对照差异显著 ( P 0 .0 5 ) 0 葡萄球菌: 感染组整个过程除4 8 h 低于对照1 个数量级以 外， 其余各时间点均在对照上下波动， 未超过 1 个数量级，与对照差异显著 (( P 0 . 0 5 ) 。同居组整个过程除1 2 h , 2 4 h 和2 8 8 h 外， 其余各 时间点均显著高于对照1 个数量级以 上，与对照差异极显著 (( P 0 .0 1 ) 0 乳酸杆菌: 感染组均在对照上下剧烈波动， 波动幅度超过6 个数量级， 与对照差异极显著 (( P 0 .0 1 ) 。同居组除4 8 h 外，其余所有时间点均高于对照， 其中，1 4 4 h 以 后的几个时间点均高于对照2 个数量级以 上，与对照差异极显著 ( P 0 . 0 1 ) 0 本次试验中我们还发现， 我们检测到的正常鸭呼吸道内大肠杆菌 / 葡萄球菌/ 乳酸杆菌数量普遍比 一些使用常规经典细菌培养方法测到的禽类呼吸道大肠杆菌数量要高1 -2 个数量级。 除了宿主的差 异和许多菌本身是厌氧菌不易培养外， 还可能是因为常规经典的细菌培养计数方法仅能够计算出活 菌的数量，而我们使用的定量P C R方法不论细菌死活， 只要存在其核酸， 均能够检测出来。至于定 量P C R方法较常规方法检测细菌的灵敏度高多少倍， 现在还暂不能定论， 因为我们在提取肠内 容物 细菌基因组D N A和定量P C R扩增过程中总有损失，具体有多少损失目 前还难以 计算。同时我们还 发现正常鸭呼吸道大肠杆菌和葡萄球菌数量在2 0 日 龄以 后并没有出 现多大变化， 各气管中大肠杆菌 / 数量几乎没有变化， 这可能是因为大肠杆菌在2 0 日 龄以 前即完成在鸭呼吸道内的定植， 趋于稳定。 而乳酸杆菌数量在2 0日 龄后却持续递减， 是什么原因造成了这样的差异?自 雏鸭出壳后， 大肠杆菌 / 葡萄球菌/ 乳酸杆菌在鸭呼吸道内的定植规律是什么?还有待我们进一步研究。 参考文献 ( 编者略) 免源高致病性大肠杆菌外膜蛋白 型的 差异性分析 李晓霞， 柴同 杰， ( 山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 2 7 1 0 1 8 ) 摘要: 提取从山 东某地区的大、中型兔场连续三年 ( 2 0 0 2 年、 2 0 0 3 年、 2 0 0 4 年) 分离、 鉴定出4 3 株高 致 病 性大 肠 杆菌的 外 膜蛋白 ( O u t e r m e m b r a n e p r o t e in , O M P ) ， 测 定 其 外 膜 蛋白 型 ( O u t e r m e m b r a n e p r o t e in p a tt e rn s ,O M P S )，比较研究不同年份间高致病性大肠杆菌 分离株的外膜蛋白型。 通过 S D S - P A G E分析， 三年共 产生了 三种O M P型 ( A - C ) 。 结果表明高 致病性大肠杆菌的 外膜蛋白 型在 同年份具有多样性; 不同 年份之间具有差异性。 关键词:兔:高致病性大肠杆菌: 外膜蛋白型 兔大肠杆菌 病是一种爆发性、 死亡率很高的 兔 肠道疾病， 该病是由 大肠杆菌 及其毒素引 起的 一种 暴发性、死亡率很高的兔肠道疾病。一年四季均可发生，各种年龄和性别都有易感性， 但主要发生 于2 0 - 7 5 日 龄仔、 幼兔。 近年来， 各兔场相继爆发 大肠杆菌 病， 发 病率高 达5 0 % ^ - 8 0 % ， 个别 兔场死亡率 在5 0 %以 上给养兔业造成了 严重经济损失。 最新研究结果表明， 测定细菌的O M P S 型是衡量不同 菌 作者简介:李晓彼( 1 9 7 8 - ) ，女，山 东烟台 人，在读博士 研究生， 基金项目 :山 东省2 0 0 1 年重点 攻关项目 “ 集约 化养兔腹泻 症病因 学 研究 ” ( 0 1 2 0 1 0 1 1 6 ) ’ 通 讯 作 者 : 柴 同 杰 ， 教 授 ， 博 士 生 导 师 ， e m a il : c h a itj @ h o tm a il .c o m 5 3 4